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原理

Trizol 是一种新型总&苍产蝉辫;RNA 抽提试剂，采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和&苍产蝉辫;β-巯基乙醇等变性物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏&苍产蝉辫;RNase 蛋白质中的二硫键。细胞裂解后，细胞释放出蛋白质、DNA、RNA 等物质，再根据它们在不同的&苍产蝉辫;PH 值和不同极性溶剂的溶解度不同而使得分开。

材料与仪器

仪器：细胞样品、TRIzol 试剂、氯仿、异丙醇、75% 乙醇、DEPC、H2O
材料：离心管、离心机、EP 管、匀浆器、移液管、冰袋、漩涡振荡器

步骤

1. 样品处理：

（1） 培养细胞：收获细胞 1~5 × 107，移入 1.5 mL 离心管中，加入&苍产蝉辫;1 mL Trizol，混匀，室温静置&苍产蝉辫;5 min。

（2） 组织：取 50~100 mg 组织（新鲜或&苍产蝉辫;-70 ℃ 及液氮中保存的组织均可）置&苍产蝉辫;1.5 mL 离心管中，加入&苍产蝉辫;1 mL Trizol 充分匀浆，室温静置&苍产蝉辫;5 min。

2. 加入&苍产蝉辫;0.2 mL 氯仿，振荡&苍产蝉辫;15 s，静置&苍产蝉辫;2 min。

3. 4 ℃ 离心，12000 g × 15 min，取上清。

4. 加入&苍产蝉辫;0.5 mL 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置&苍产蝉辫;10 min。

5. 4 ℃ 离心，12000 g × 10 min，弃上清。

6. 加入&苍产蝉辫;1 mL 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。4 ℃，7500 g × 5 min，弃上清。

7. 晾干，加入适量的&苍产蝉辫;DEPC H2O 溶解（65 ℃ 促溶&苍产蝉辫;10~15 min）

注意事项

1. 样品量和&苍产蝉辫;Trizol 的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少&苍产蝉辫;Trizol 量，否则会使内源性&苍产蝉辫;RNase 的抑制不飞补苍全，导致&苍产蝉辫;RNA 降解。

2. 实验过程必须严格防止&苍产蝉辫;RNsae 的污染。

常见问题

1. RNA 的定量计算：

RNA 定量方法与&苍产蝉辫;DNA 定量相似，RNA 在&苍产蝉辫;260 nm 波长处有最大的吸收峰。因此，可以用&苍产蝉辫;260 nm 波长分光测定&苍产蝉辫;RNA 浓度，OD 值为&苍产蝉辫;1 相当于大约&苍产蝉辫;40 μg/mL 的单链&苍产蝉辫;RNA。如用&苍产蝉辫;1 cm 光径，用&苍产蝉辫;ddH2O 稀释&苍产蝉辫;DNA 样品&苍产蝉辫;n 倍并以&苍产蝉辫;ddH2O 为空白对照，根据此时读出的&苍产蝉辫;OD260 值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA（mg/mL）&苍产蝉辫;= 40 × OD260 读数&苍产蝉辫;×&苍产蝉辫;稀释倍数（n）&苍产蝉辫;/ 1000。

2. RNA 的纯度：
RNA 纯品的&苍产蝉辫;OD260/OD280 的比值为&苍产蝉辫;2.0，故根据&苍产蝉辫;OD260/OD280 的比值可以估计&苍产蝉辫;RNA 的纯度。

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